高产菌种诱变育种流程？一、实验目的和内容目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。内容：1．对米曲霉#28Aspergills oryzae #29出发菌株进行处理，制备孢子悬液
高产菌种诱变育种流程？
一、实验目的和内容
目的：以紫外线诱变获(繁体：獲)得用于yú 酱油生产的高产蛋白酶菌株为例《练：lì》，学习微生物诱变育种的基本操作方法。
内容：1．对米曲霉#28Aspergills oryzae #29出发菌株进行处理，制备孢子悬液。
2．用紫外线进《繁体：進》行诱变处理。
3．用平píng 板透明圈法进行两次初筛。
4．用摇瓶法进行复{练：fù}筛及酶活性测定。
二、实验材[世界杯读：cái]料和用具
米曲（繁体：麴）霉斜面菌种；
豆饼斜xié 面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白；
三角瓶（píng）#28300mL、500mL#29、试管、培养【yǎng】皿#289cm#29、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无(繁：無)菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。
三、操作[zuò]步骤
#28一#29出发菌株的[拼音：de]选择及菌悬液制备
1．出发菌株的选择 可直接选用生产酱jiàng 油的米曲【pinyin：qū】霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。
2. 菌悬液制备 取出发菌株转接【jiē】至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶[练：píng]中#28内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜#29，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108 个/mL，冷冻保藏备用。
#28二#29诱变处理lǐ
用物理方法或化学方法，所用诱变[繁：變]剂种类及剂量的（de）选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。
1．紫外线处理 打开紫外灯#2830W#29预热20min。取5mL 菌悬液放在无（繁：無）菌的培养皿#289cm#29中，同时制作5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm#28垂直距离#29处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为(繁：爲)15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑【拼音：hēi】暗冷（lěng）冻中保存1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。
2．稀释菌悬液 按10 倍稀释至10-6，从10-5 和10-6 中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中澳门博彩#28每个稀释度[拼音：dù]均做3 个重复#29，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。
#28三#29优良菌株（练：zhū）的筛选
1. 初筛 首先观察在菌落周围（繁：圍）出现的透明圈大小【拼音：xiǎo】，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50 个，作为复筛菌株。
2．平板复筛 分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8 等份，1～7 份中《拼音：zhōng》点种初筛菌株，第8 份点种原始菌株，作为(繁：爲)对照。培养48h 后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进大摇瓶复筛阶段。
3．摇瓶复筛 将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养（繁体：養）基（jī）中进行培养，其方法是，称取麦秩85g，豆饼粉#28或面粉#2915g，加水95～110mL#28称为润水#29，水含量以手捏后指缝有水而不
下滴为宜，于500mL 三角瓶中装入15～20g#28料厚为1～1.5cm#29，121℃湿热灭菌30min，然后分别接入以上初筛获得的优良菌株，30℃培养，24h 后摇瓶一次并均匀铺开，再zài 培养24～48h，共培养3～5d 后检测[繁：測]蛋白酶活性。
4．蛋dàn 白酶的测定方法
#281#29取样：培养后随机称取以上摇瓶培养物1g，加（读：jiā）蒸馏{练：liú}水100mL，#28或200mL#29，40℃水浴，浸（拼音：jìn）酶1h，取上清浸液测定酶活性。另取lg 培养物于105℃烘干测定含水量。
#282#29酶活性测定：30℃ pH7.5 条件下水解【pinyin：jiě】酪蛋白#28底物为0.5%酪蛋白#29，每分《pinyin：fēn》钟产酪氨酸1μg 为一个酶《拼音：méi》活力单位。计算公式为：
#28A 样品OD680nm 值（拼音：zhí）-A 对照OD680nm 值#29×K×V/t×N
K：标准曲线中光吸收为《繁：爲》“1”时的酪氨酸微克数；
V：酶促反应的[de]总体积；
极速赛车/北京赛车t： 酶促反{pinyin：fǎn}应时间#28min#29；
N：酶[练：méi]的稀释倍数。
5．谷（繁：穀）氨酸的检测 此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之一。
检测培养[yǎng]基：豆饼粉：麸夫=6：4，润水75%，121℃湿热灭菌30min。
谷氨酸测定：于以上培养基中加入7%盐水【shuǐ】#28W/V#29，40～45℃水浴，水解9d 后过滤，以滤液检测谷氨酸含量#28测压(繁：壓)法#29。
四、注意事项《繁：項》
1. 紫外线照射时注意保护眼《读：yǎn》睛和皮肤。
2. 诱变过程及诱变后的稀释操作均在红[繁：紅]灯下进行，并在黑暗中培养。
五、实验[拼音：yàn]报告
1. 试列{拼音：liè}表说明高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果。
2. 你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改【练：gǎi】进？
六、问（繁体：問）题和思考
1．世界杯试述紫外线诱变的作用机理及其在《拼音：zài》具体操作中应注意的问题。
2．为什么在诱变前要把菌悬液yè 打散和培养一段时间？
注：筛选（读：xuǎn）菌株数的(pinyin：de)计算 若按突变率为0.01 计算，则一次筛选可取250—300 个菌落，
第一次筛选后可多选几株高产株，而二级筛选为重点阶段，其最适量可参考以下计算方法：如初筛菌株数为200 株，二次筛选欲选株数为2 株，则二级应选#28200×2澳门新葡京#291/2，为20 株《pinyin：zhū》，这样的数量选择，使有可能从较少的数量中获得相对较多的优良菌株。
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