高产菌种诱变育种流程？一、实验目的和内容目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。内容：1．对米曲霉#28Aspergills oryzae #29出发菌株进行处理，制备孢子悬液
高产菌种诱变育种流程？
一、实验目的和内容目的[读：de]：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生【pinyin：shēng】物诱变育种的基本操作方法。
内容：1．对米曲《繁体：麴》霉#28Aspergills oryzae #29出发菌株进行处理，制备孢子悬液。
2．用（读：yòng）紫外线进行诱变处理。
3．用平板透明圈法进《繁体：進》行两次初筛。
4．用摇瓶【拼音：píng】法进行复筛及酶活性测定。
二、实验材料和用具jù
米曲霉【pinyin：méi】斜面菌种；
豆饼斜面培养基、酪素培养（繁：養）基、蒸馏水、0.5%酪蛋白；
三角瓶#28300mL、500mL#29、试管、培养皿#289cm#29、恒温摇床、恒温培{拼音：péi}养箱、紫外照射箱、磁力搅拌(拼音：bàn)器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒《读：jiǔ》精灯。
三、操作步骤《繁：驟》
#28一#29出《繁：齣》发菌株的选择及菌悬液制备
1．出发菌株的选【练：xuǎn】择 可直接选用生产酱油的【拼音：de】米曲霉（繁：黴）菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。
2. 菌悬液制备 取出发菌株转接至豆饼【练：bǐng】斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中#28内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜#29，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108 个/mL，冷冻保藏备（繁：備）用。
#28二#29诱变处理{pinyin：lǐ}
用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决（繁体：決）定，有时还可采用复合处理，可《读：kě》获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。
1．紫外线处世界杯理 打开紫外灯#2830W#29预热20min。取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿（读：mǐn）#289cm#29中，同时制作5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm#28垂直距离#29处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。
2．稀释菌悬液（pinyin：yè） 按10 倍稀释至10-6，从10-5 和10-6 中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中#28每个稀释度均做3 个重复#29，然后涂菌并静置，待菌液渗入培(练：péi)养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。
#28三#29优良菌株的（练：de）筛选
1. 初筛 首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50 个，作为《繁体：爲》复筛(繁：篩)菌株。
2．平板复筛 分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8 等份，1～7 份中点种初筛菌株，第8 份点种原始菌株，作为对照。培养48h 后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优[繁：優]良菌株，进[繁体：進]大摇瓶复筛阶（繁：階）段。
3．摇瓶复筛【繁：篩】 将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取{pinyin：qǔ}麦秩85g，豆饼粉#28或面粉#2915g，加水95～110mL#28称为润水#29，水含量以手捏后指缝有水shuǐ 而不
下滴为宜，于500mL 三角瓶中装入15～20g#28料厚为1～1.5cm#29，121℃湿热(繁体：熱)灭菌30m世界杯in，然后分别接入以上初筛获得的优良菌株，30℃培养，24h 后摇瓶一次并均匀铺开，再培养24～48h，共培养3～5d 后检测蛋白酶活性。
4．蛋白酶的测定《拼音：dìng》方法
#281#29取(拼音：qǔ)样：培养后随机称取以上摇瓶培养物1g，加蒸馏水100mL，#28或200mL#29，40℃水浴，浸酶1h，取上清浸液测定[pinyin：dìng]酶《读：méi》活性。另取lg 培养物于105℃烘干测定含水量。
#282#29酶活性测定：30℃ pH7.5 条件下水解酪蛋白#28底物为0.5%酪蛋白#29，每分钟产酪氨酸1μg 为一个酶活力单位。计算公式为：
#28A 样品OD680nm 值-A 对[繁体：對]照OD680nm 值#29×K×V/t×N
K：标准曲线中光吸收为“1”时的酪氨酸微克数《繁体：數》；
V：酶促反应的总（繁体：總）体积；
t： 酶促反{fǎn}应时间#28min#29；
N：澳门博彩酶的稀释《繁：釋》倍数。
5．谷氨酸的检测 此项检测也是【拼音：shì】酱油优良菌株的重要指标之一。
检测培养基：豆饼粉：麸夫=6：4，润水75%，121℃湿shī 热灭菌30min。
谷氨酸测定：于以上(拼音：shàng)培养基中加入7%盐水#28W/V#29，40～45℃水浴，水解9d 后过滤，以滤液检测谷氨酸含量#28测压[繁体：壓]法#29。
四、注意事[pinyin：shì]项
1. 紫外线照射时注意保(练：bǎo)护眼睛和皮肤。
2. 诱变过程及诱变后的稀释操作均在红(繁体：紅)灯下进行，并在黑暗中培养。
五【wǔ澳门新葡京】、实验报告
1. 试列表说明（pinyin：míng）高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果。
2. 你认为以上的筛选方fāng 法有什么优缺点，如何改进？
六、问题（繁：題）和思考
1．试述紫外线诱变的作用【拼音：yòng】机理及其在具体操作中应注意的问题。
2．为什么在诱变（繁：變）前要把菌悬液打散和培养一段时间？
注：筛选菌株数[繁：數]的《读：de》计算 若按突变率为0.01 计算，则一次筛选可取《练：qǔ》250—300 个菌落，
第一次筛选后可多选几株高产株，而二级筛选为重点阶段，其最适量可参考以下计算方法：如初筛菌株数为200 株，二次筛选欲世界杯选株数为2 株，则二级应选#28200×2#291/2，为20 株，这样的数量选择，使有可能从较少(读：shǎo)的数量中获得相对较多的优良菌株。
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