高产菌种诱变育种流程？一、实验目的和内容目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。内容：1．对米曲霉#28Aspergills oryzae #29出发菌株进行处理，制备孢子悬液
高产菌种诱变育种流程？
一、实验目的和内容目的：以紫外线诱变获得用于酱油（pinyin：yóu）生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生《拼音：shēng》物诱变育种的基本操作方法{fǎ}。
内（读：nèi）容：1．对米曲霉#28Aspergills oryzae #29出发菌株进行处理，制备孢子悬液。
2．用紫外线进行诱变[繁：變]处理。
3．用(pinyin：yòng)平板透明圈法进行两次初筛。
4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测(繁：測)定。
二、实验材料（liào）和用具
米曲霉斜面[拼音：miàn]菌种；
豆饼斜面培养基、酪素培{pé澳门银河i}养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白；
三角瓶#28300mL、500mL#29、试管、培养皿#289cm#29、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗[繁：鬥]、玻璃珠(pinyin：zhū)、移液管、涂布（繁：佈）器、酒精灯。
三、操作{练：zuò}步骤
#28一#29出发菌株的选《繁体：選》择及菌悬液制备
1．出发菌株的选择 可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用[练：yòng]高产蛋白酶（pinyin：méi）的米曲霉《繁：黴》菌株。
2. 菌悬液制备 取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓[繁：緩]冲液的三角瓶中#28内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜[练：yí]#29，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108 个/mL，冷冻保藏备用。
#28二#29诱变处理【lǐ】
用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有{pinyin：yǒu}时还可采用复(繁：覆)合处理，可获得更好的结果。本实验学习《繁：習》用紫外线照射的诱变方法。
1．紫外线处理 打开紫外灯#2830W#29预热20min。取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿#289cm#29中，同时制作5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm#28垂直距离#29处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照{练：zhào}射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h 然后在红【繁：紅】灯下稀释涂菌进行初筛。
2．稀释菌悬液 按{练：àn}10 倍稀释至10-6，从10-5 和10-6 中各取出0.lmL 加入到酪素培养《繁体：養》基平板中#28每个稀释度均做3 个重复#29，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。
#28三{sān}#29优良菌株的筛选
1. 初筛 首先观察在菌落周围出现的（de）透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比{bǐ}，选择其比值大且菌落直【读：zhí】径也大的菌落40～50 个，作为复筛菌株。
2．平板复筛 分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8 等份，1～7 份{fèn}中点种初筛菌株，第8 份点种原始菌株，作为对照。培养48h 后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进大【读：dà】摇瓶复筛阶段。
3．摇瓶复筛 将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养《繁：養》基中进行培养，其方法是，称取[pinyin：qǔ]麦秩85g，豆饼粉#28或面（繁体：麪）粉#2915g，加水95～110mL#28称为润水#29，水含量以手捏后指缝有水而不
下滴为(wèi)宜，于500mL 三角瓶中装入15～20g#28料厚为1～1.5cm#29，121℃湿热灭菌30min，然后分别接入以上初筛获得的优良菌株，30℃培养(繁：養)，24h 后摇瓶一次并均匀铺开，再培养24～48h，共培养3～5d 后检测蛋白酶活性。
4．蛋白酶的测定[dìng]方法
#281#29取样：培《拼音：péi》养后随机称取以上摇瓶培养物1g，加蒸馏水100mL，#28或(pinyin：huò)200mL#29，40℃水浴，浸酶1h，取上清浸液测{pinyin：cè}定酶活性。另取lg 培养物于105℃烘干测定含水量。
#282#29酶活性测定：30℃ pH7.5 条件下水解酪蛋白#28底物为0.5%酪蛋白#29，每分钟产酪氨酸1μg 为一个酶活力单位《wèi》。计算公式《读：shì》为：
#28A 澳门威尼斯人样品OD680nm 值-A 对照【读：zhào】OD680nm 值#29×K×V/t×N
K：标准曲线中（pinyin：zhōng）光吸收为“1”时的酪氨酸微克数；
V：酶促反应的总体积《繁体：積》；
t： 酶促《拼音：cù》反应时间#28min#29；
N：酶的【练：de】稀释倍数。
5．谷氨酸的检测 此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之{pinyin：zhī}一。
检测培养基：豆《拼音：dòu》饼粉：麸夫=6：4，润水75%，121℃湿热灭菌30min。
谷氨酸（繁：痠）测定【读：dìng】：于以上培养基中加入7%盐水#28W/V#29，40～45℃水浴，水解9d 后过滤，以滤液检测谷氨酸含量#28测压《繁体：壓》法#29。
四、注意事项《繁：項》
1. 紫外线照射时注意保护眼极速赛车/北京赛车睛和皮肤{繁体：膚}。
2. 诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行，并在黑暗《繁：闇》中培养。
五、实(繁：實)验报告
1. 试列表说明高产蛋白澳门银河酶菌株的筛选过程和结果(拼音：guǒ)。
2. 你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改进？
六（pinyin：liù）、问题和思考
1．试述紫外线诱变(biàn)的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。
2．为什么在诱变前要把《拼音：bǎ》菌悬液打散和培养一段时间？
注：筛选菌株数【练：shù】的计算 若按突变率为0.01 计算，则一{yī}次筛选（繁体：選）可取250—300 个菌落，
第一次筛选后可多选几株高产株，而二级筛选为重点阶段，其最适量可参考以下计算方法：如初(pinyin：chū)筛菌株数为20开云体育0 株，二次筛选欲选株数为2 株，则二级应选#28200×2#291/2，为20 株，这样的数量选择，使有可能从较少的数量中获得相对较多的优良菌株。
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